El principio activo del clotrimazol se basa en su carácter de derivado imidazólico: como tal, lo que hace es inhibir un enzima (lanosterol-14-desmetilasa) necesario para la biosíntesis del ergosterol, un componente fundamental de la membrana celular fúngica.
Al inhibir la síntesis del ergosterol, se produce una deficiencia de este componente; la consecuencia es una alteración de la permeabilidad de la pared celular del hongo y finalmente la citólisis.